骆丽如，曾泽南，谢文杰，等.桑树内生真菌的分离、鉴定及其对DNJ生物合成的影响[J].食品研究与开发，2020，41（23）：185-191

LUO Liru，ZENG Zenan，XIE Wenjie，et and Identification of Endophytic Fungi from Mulberry and Their Effects on DNJ Biosynthesis[J].Food Research and Development，2020，41（23）：185-191

桑树枝叶的药用功效在《本草纲目》已有较多记载[1-2]，且我国已将桑树枝叶作为治疗消渴症（糖尿病）的中药之一，应用于临床[3]。上个世纪80年代，日本科学家指出，桑树枝叶中的1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）是治疗糖尿病的有效物质[4-5]。DNJ的化学结构[6]与葡萄糖相似，是桑树枝叶中的一种哌啶生物碱[7-8]。在自然界中，桑树枝叶中DNJ含量最高[9]。周炎等[10]通过灌胃等量桑枝水提液、二倍量桑枝水提液、盐酸二甲双胍片，高血糖小白鼠的血糖值4周后分别下降了7.63%、15.72%、18.41%，综合相关研究表明，桑叶枝叶中丰富的DNJ是α-葡萄糖苷酶的一种抑制剂[11]，具有降低血糖[12-15]、抑制病毒活性和抑制肿瘤转移等作用[16-18]。

微波提取法、超声波辅助提取法和超临界萃取技术[19-20]等作为新技术已经应用于DNJ的提取，其中胡瑞君等[21]利用微波萃取技术提取桑叶中DNJ，确定最佳提取工艺条件为：微波功率406 W，微波处理时间1.5 min，固液比 1 ∶40（g/mL），提取次数 2 次，DNJ提取率为0.024%。花俊丽等[22]通过超声波辅助提取法确定了提取DNJ的最佳条件为：超声功率125 W，每克桑叶浸提剂用量40 mL，超声温度70℃，超声时间20 min，DNJ的得率为0.091%。由于DNJ分子在紫外、可见光波段内无吸收峰，因此常规的分光光度法无法检测其存在和含量[23]，而常采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法[24-25]、柱前衍生化高效液相色谱法[26-27]、气相法[28]等方法检测DNJ。

研究与开发内生真菌已成为解决某些植物药药源危机的最佳途径之一[29]。现已证明，内生真菌能够参与植物活性成分的合成或对植物的次级代谢产物有转化作用[30]。同时，桑树内生真菌具有丰富的生物多样性[31]且能产生黄酮类物质[32]。本试验通过分离桑树中内生真菌及其发酵试验，培养并鉴定内生真菌，通过FMOCCl柱前衍生化高效液相色谱法对其产生的DNJ进行分析，初步认为有望利用该菌株提高DNJ的产率。

1 材料与方法

1.1 试验材料

桑树健康枝条采摘于浏阳河畔（系统随机抽样）：桑叶粉末由湖南农业大学生物科学技术学院实验室提供；土豆：市售。

1.2 主要仪器设备

CR21G高速冷冻智能离心机：日本日立公司；SWCJ-1B单人单面净化工作台：苏州净化设备有限公司；DK-8B电热恒温水浴锅、GRX20干热消毒箱、SYC-L1电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；TOMY SS-325湿热灭菌锅：Tomy KOGYO有限公司；AL204电子天平：梅特勒—托利多仪器（上海）有限公司；PHB-1笔型pH计：上海宇龙仪器有限公司；PYX-250Z-A振荡培养箱：广东韶关科力实验仪器有限公司；1200Series高效液相色谱仪、ZORBAX Eclipse XDB C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）：安捷伦科技有限公司；BCD-216ZDJ海尔冰箱：青岛海尔股份有限公司。

1.3 试剂

DNJ（纯度 99%）：Sigma公司；芴甲氧羰酰氯（9-fluorenylmethyl chloroformate，FMOC-Cl）（纯度 98%）：上海共价化学科技有限公司；95%酒精、葡萄糖（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；四硼酸钠（分析纯）：中国医药（集团）上海化学试剂公司；琼脂粉末：北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；100万单位注射用硫酸链霉素：华北制药股份有限公司；甲醇（色谱纯）：SK化工；冰乙酸（分析纯）：天津市博迪化工有限公司。

1.4 培养基

分离与保藏培养基：土豆20%、葡萄糖2%、琼脂1.8%～2.0%，自然pH，121℃灭菌25 min，灭菌后加入100 μg/mL硫酸链霉素。

发酵培养基：20%土豆、2%葡萄糖。自然pH，121℃灭菌25 min。

1.5 方法

1.5.1 内生真菌的分离培养和鉴定

参照梁嘉俊的方法[33]分离桑树产生的内生真菌。用自来水冲洗直径约0.5 cm的新鲜健康桑树枝条，晾干后将其切成长度约1.5 cm数小段。在超净工作台上，依照下列过程按无菌操作方法对其进行表面灭菌：首先用75%的酒精漂洗3 min～5 min，无菌水冲洗3次～4次，再用0.1%升汞漂洗15 min，最后用无菌水冲洗5次。将已灭菌处理的桑树枝条在已灭菌的培养皿中沿枝条纵向切成两半（直径0.5 cm左右、长度为1.5 cm左右的半圆柱形），用已灭菌的镊子将其接种于马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基平板上（将纵切面接触培养基），然后将平板置于28℃恒温培养箱中培养，每日观察并检查是否有杂菌污染；待与培养基接触的纵切面边缘有菌丝体长出，将菌丝体转接到新的PDA培养基平板上进行分离纯化；经过多次分离纯化，将菌丝体接种于试管斜面，保存备用。

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